この機に乗じて後醍醐天皇は閏２月に隠岐国からの脱出に成功し、伯耆国の土豪・名和長年らに迎えられて伯耆国船上山に拠ると、この天皇を討つため鎌倉幕府から足利尊氏らが派遣されたが、密かに討幕の綸旨を受けていた尊氏はこれに応じ、５月に赤松則村・千種忠顕らと六波羅探題を攻略した。また同月２２日には新田義貞が鎌倉を攻略して執権・北条高時を自刃させたことにより、鎌倉幕府はここに滅亡した。
六波羅探題陥落を知って直ちに帰京の途についた後醍醐天皇は途中で光厳天皇を廃し、光厳天皇時代に昇任した公卿の官爵を削るなど光厳天皇の治世そのものを否認、６月５日に還京して公家（天皇）一統の政治が開始されることになった。翌年に元号が建武と改元されたので、後醍醐天皇による新しい政治は建武新政（または建武中興）と呼ばれる。
後醍醐天皇は親政開始の当初から綸旨による専制政治を目指していたが、この新政においてその志向は一層強まり、それまで鎌倉幕府が所管していた武家の所領問題などのことをも綸旨で処理しようとしたが膨大な量の奏事を処理しきれず、あるいは手違いなどが続出したために混乱を招くこととなった。これに対処するため同年９月頃には雑訴決断所を新設し、綸旨に加えてこの機関の承認を得て初めて発効するようにすることで混乱は終息に向かったが、その反面において綸旨の権威は低下することになった。
政事においては、登用した人材が天皇の側近や討幕に活躍した武士などに偏重していたため、官職を家業として世襲してきた公家の反発を招き、恩賞面においても武士にも公家にも不満が大きかったといわれ、至るところで綻びが生じていたのである。
そして建武２年（１３３５）には新政に対する公家の一部や多くの武士の不満が一挙に噴出することになった。６月には西園寺公宗らの謀叛事件が露見、ついで７月には北条時行らが挙兵し（中先代の乱）、これを鎮圧するために関東に下向した足利尊氏もが鎮圧した後も鎌倉に留まり、新田義貞を奸臣と称して除くことを名目に挙兵するに至ったのである。
翌建武３：延元元年（１３３６）１月、進攻してきた尊氏の入京を前に後醍醐天皇は比叡山に難を避けたが、綸旨に応じて陸奥国から長征してきた北畠顕家らの活躍で一旦は尊氏を九州に奔らすことができた。しかし尊氏が持明院統の光厳上皇の院宣と錦旗を受けて勢力を盛り返して西上してくると後醍醐天皇は５月に再び比叡山に難を避け、楠木正成・新田義貞らを迎撃に差し下したが破られ、６月には光厳上皇とその同母弟・豊仁親王を伴った尊氏の入京を許すこととなった。
８月、尊氏が豊仁親王を光明天皇として擁立すると後醍醐天皇は譲位を余儀なくされ、１０月に皇子・恒良親王を新田義貞と共に北国に下向させたあとに還京し、１１月２日に光明天皇に神器を授与した。ついで１１月７日に尊氏は建武式目を制定して事実上幕府を再興、建武政権は２年５ヶ月で瓦解したのである。
だが後醍醐天皇は１２月に幽閉先の花山院御所を脱出して吉野に移り、自らを正統な天皇と主張して朝廷を興したため皇家は分裂することになり、以後、後醍醐天皇方を南朝、光明天皇方を北朝という。
建武４：延元２年（１３３７）、南北両軍は河内・和泉国をはじめとして各地で交戦し、天皇は陸奥国に帰任していた北畠顕家に再度の上洛を促した。顕家は建武５（＝暦応元）：延元３年（１３３８）２月頃にようやく近畿に至ったが、５月に和泉国石津で戦死。そして新田義貞も閏７月に越前国藤島で戦死し、軍事面での大きな支柱を失った。
このあと南朝は東国からの再建を図るために、北畠親房・白川（結城）宗広らが海路で下向しようとしたが、海上で暴風雨に遭って遭難してしまい、その目的を果たし得なかった。
こうして南朝が軍事的に劣勢となったなかの暦応２：延元４年（１３３９）８月１６日、後醍醐天皇は行宮の吉野金峰山寺塔頭金輪王寺で崩御した。享年５２。如意輪寺の傍に塔尾陵が営まれた。追号後醍醐は、遺勅によるといわれる。なお、崩御の前日に南朝の皇位は義良親王（後村上天皇）に譲位されていた。
崩御を深く悲しんだ足利尊氏は雑訴沙汰を７日間止めるとともに、天皇ゆかりの亀山殿を改めて天龍寺を建立して冥福を祈った。明治２２年（１８８９）には、天皇を祭神とする吉野神宮が創祀されている。
天皇の著書に『建武年中行事』『建武日中行事』がある。
新待賢門院・新室町院はじめ皇后や寵を受けた女性は多く、皇子１７名、皇女１５名を数える（『本朝皇胤紹運録』）。