井伊直政の二男。井伊直継（別称を直勝）の異母弟。母は井伊家臣・印具徳右衛門の娘。天正１８年（１５９０）２月１１日に生まれる。通称は弁之介。正四位上・掃部頭・侍従・左中将。近江国彦根藩主。
慶長８年（１６０３）より江戸幕府２代将軍・徳川秀忠に仕え、慶長１０年（１６０５）に従五位下・掃部助。慶長１３年（１６０８）に書院番頭として５千石、慶長１５年（１６１０）には大番頭に任じられて５千石の加増を得て上野国白井に１万石を領し、掃部頭を称した。
慶長１９年（１６１４）の大坂冬の陣には、兄・直継に代って出陣した。これは直継が病身だったためとされるが、直孝が直継よりも器量に優れていたため、ともいう。
父・直政が慶長７年（１６０２）に没したあとは嫡男の直継が井伊氏の家督を継いで近江国彦根藩主となっていたが、慶長２０年（＝元和元年：１６１５）２月、秀忠の父・徳川家康は直孝を彦根藩主に任じて１５万石を知行させ、直継を上野国安中で３万石に封じるという沙汰を下した。これは実質的な家督交代であり、先述の大坂冬の陣に際しての後者の見方を裏付けるものと言えよう。
同年の大坂夏の陣では八尾・若江の合戦で木村重成を討ち、その功績で戦後に５万石を加増され、従四位下・侍従に任じられた。さらに元和３年（１６１７）と寛永１０年（１６３３）にも５万石ずつ加増され、近江国で２８万石、下野・武蔵国で２万石を領する大大名となる。
位階においても累進を遂げ、寛永３年（１６２６）に少将、正保２年（１６４５）には４代将軍・徳川家綱の元服時に加冠役を務め、正四位上・左中将に昇進した。
この間の寛永８年（１６３１）頃より江戸への出府を命じられ、老臣として３代将軍・徳川家光、４代将軍・家綱の時代に亘って江戸に在って幕政に参与した。
万治２年（１６５９）６月２８日に死去、享年７０。世田谷の豪徳寺に葬られ、豪徳天英久昌院と号す。